Exon - Chauffage ATM du Yunnan Co., Ltd

Scientific Reports volume 6, Numéro d'article : 18741 (2016) Citer cet article

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L'ATM est un gène important de susceptibilité au cancer qui code pour une kinase apicale critique de la voie de réponse aux dommages de l'ADN (DDR). Nous montrons qu'un exon de commutateur de désintégration d'ARN (NSE) clé médié par un non-sens dans ATM est réprimé par U2AF, PUF60 et hnRNPA1. L'activation du NSE était spécifique à l'haplotype et était principalement favorisée par la cytosine au niveau de rs609261 dans le site d'épissage NSE 3 '(3'ss), qui est prédominant dans les populations à haut risque de cancer. Les niveaux de NSE ont été dérégulés dans les leucémies et ont été influencés par l'identité du résidu 34 U2AF35. Nous identifions également des oligonucléotides à commutation d'épissage (SSO) qui exploitent la compétition des pseudoexons adjacents pour moduler les niveaux de NSE. L'utilisation de l'exon régulé par U2AF dans la voie de signalisation ATM était centrée sur l'axe MRN/ATM-CHEK2-CDC25-cdc2/cycline-B et impliquait préférentiellement les transcrits impliqués dans les fusions de gènes et les translocations chromosomiques associées au cancer. Ces résultats révèlent des liens importants entre le contrôle des 3 et les réponses dépendantes de l'ATM aux cassures de l'ADN double brin, démontrent la plasticité fonctionnelle des variantes introniques et illustrent la polyvalence des SSO introniques qui ciblent les pseudo-3 pour modifier l'expression des gènes.

Les introns sont éliminés par un grand complexe ARN-protéine hautement dynamique appelé spliceosome, qui orchestre des interactions complexes entre les transcrits primaires, les petits ARN nucléaires (snRNA) et un grand nombre de protéines1. Les spliceosomes s'assemblent ad hoc sur chaque intron de manière ordonnée, en commençant par la reconnaissance du site d'épissage 5' (5'ss) par le snRNA U1 ou du 3′ss par la voie U21,2, ce qui implique la liaison du facteur auxiliaire U2 ( U2AF) vers la région 3′ss pour faciliter la reconnaissance par U2 de la séquence de points de branchement (BPS)3. U2AF est un hétérodimère stable composé d'une sous-unité de 65 kD codée par U2AF2 (U2AF65), qui se lie au tractus polypyrimidine (PPT) et d'une sous-unité de 35 kD codée par U2AF1 (U2AF35), qui interagit avec des dinucléotides AG hautement conservés en 3 ' ss et stabilise la liaison U2AF654. En plus de l'unité BPS/PPT et des 3′ss/5′ss, un épissage précis nécessite des séquences ou des structures auxiliaires qui activent ou répriment la reconnaissance du site d'épissage, appelées amplificateurs ou silencieux d'épissage introniques ou exoniques. Ces éléments permettent de reconnaître de véritables sites d'épissage parmi un vaste excès de sites cryptiques ou pseudo-sites dans le génome des eucaryotes supérieurs, qui ont des séquences similaires mais sont d'un ordre de grandeur plus nombreux que les sites authentiques5. Bien qu’ils aient souvent une fonction régulatrice6, les mécanismes moléculaires de leur répression sont mal compris.

Des études de séquençage de l'exome ont révélé un schéma restreint de mutations somatiques dans U2AF1/U2AF2 et d'autres gènes impliqués dans la reconnaissance de 3's dans les cellules cancéreuses, notamment SF3B1, ZRSR2, SF1, SF3A1, PRPF40B et SRSF2 (examiné dans7). Ces gènes codent pour des produits qui interagissent souvent lors de l'assemblage des spliceosomes8,9,10 et présentent un degré élevé d'exclusivité mutuelle des mutations associées au cancer7, indiquant l'existence d'une voie oncogène partagée. Le profilage du transcriptome dans les leucémies porteuses de ces mutations a détecté de nombreuses altérations dans l'épissage des précurseurs de l'ARNm7, mais les liens clés entre les défauts spécifiques du traitement de l'ARN et l'initiation ou la progression du cancer sont restés obscurs, malgré la grande promesse de ces cibles pour la modulation thérapeutique. En outre, on ne sait pas clairement pourquoi le modèle de mutation très restreint dans ces cellules n’a pas été associé à un ensemble limité et clairement défini de défauts de traitement de l’ARN dotés de propriétés oncogènes. En outre, l'utilisation des exons dans les gènes DDR, acteurs essentiels de la transformation maligne, n'a pas été entièrement caractérisée dans les cellules dépourvues de facteurs de traitement 3 et les variantes naturelles de l'ADN qui influencent leur activation sont inconnues.

TAG>AAG>GAG hierarchy of exon inclusion levels at the 3′ss consensus15. To confirm that the NSE usage is allele-specific, we examined splicing of two reporter constructs that contained C or T at this position following transient transfections into HEK293 cells (Fig. 2b). As expected, the T construct yielded lower NSE inclusion than the C reporter, both in untreated cells and cells individually depleted of each U2AF subunit (Fig. 2c)./p>G13. We noticed that this mutation activated the NSE 3′ss while repressing its 5’ss and promoting a downstream 5’ss instead, introducing a 112-nt cryptic exon in the mRNA13. We also noticed that within this exon, there was a strong 3′ss consensus preceded by optimal BPS/PPT motifs, which may bind U2AF and activate a smaller, 24-nt pseudoexon (termed PE; Fig. 4a). Examination of published RNA crosslinking/immunoprecipitation data20 in ATM showed U2AF65 binding upstream and downstream of NSE and upstream of PE, suggesting that NSE activation may be controlled by competition between partially productive spliceosomes assembled at the PE 3′ss and the NSE 3′ss. The two 3′ss are conserved in mammals and are separated by a distance smaller than the minimal intron size, sterically preventing simultaneous recognition of NSE and PE (Fig. 4a). Deletion of the PE PPT/3′ss introduced in the C minigene, which should alleviate NSE repression through diminished U2AF binding to PE, increased NSE inclusion (Fig. 4b), in agreement with the 3′ss competition. This deletion also induced retention of the intron that separates NSE and PE, mimicking the splicing pattern of the A-T mutation IVS28-159A >G. Increasing the intron length from 59 to 79 nt, thereby overcoming a steric hindrance imposed by the insufficient distance between the two pseudo-3′ss, also improved NSE inclusion and diminished the intron retention (Fig. 4b)./p>G substitution13. In this A-T case, both NSE and PE were included in the ATM mRNA together with the intervening sequence. Canonical and aberrant transcripts are denoted by dotted lines above and below the pre-mRNA. Middle panel shows RNA-Seq read densities for NSE in cells depleted of both U2AF35 isoforms (ab-) together with U2AF65 tags/high-confidence binding sites (horizontal lines/rectangles) identified by crosslinking and immunoprecipitation20. The 100 basewise vertebrate conservation by Phylop (100 VC) is at the bottom. The lower panel shows mutations (in red and underlined) introduced in the C-minigene. (b) Splicing pattern of wildtype and mutated C minigenes. Mutations are at the bottom of panel (a); RNA products are shown schematically to the right. The largest product produced by clone PE delPPT/AG includes the shortened pseudointron. (c) Splicing pattern of C minigenes mutated in NSE (lanes 2, 3, 7 and 8) or PE (lanes 4, 5, 9 and 10) in (mock)-depleted HEK293 cells. Mutations are at the bottom; their sequences are in Table S2. Spliced products are schematically shown to the right. A hairpin symbol above PE denotes the MIR stem-loop insertion; cr3’ss, a cryptic 3’ss activation 7 nt downstream of the authentic NSE 3’ss. (d,e) SSO-induced pseudoexon switching. Transfected minigenes are shown at the top, spliced products to the right and SSOs at the bottom. SSO sequences are in Table S1. Final concentration of SSOs shown in panels (d–g) was 3, 10 and 30 nM. (f) PE SSOs induced NSE skipping. (g) SSOs targeting a sequence that activates NSE upon deletion (PEdelPPT/AG; panel a and b) inhibit PE. (h) NSE activation is haplotype-dependent. Minigene haplotypes at the indicated variants are at the bottom. Columns represent mean NSE inclusion, error bars are SDs, asterisks denote statistically significant differences as in Fig. 1b./p>TG > TA./p>

G62, despite targeting U2AF binding sites (Fig. 4a). This suggests that the morpholino blocked access to structures or motifs that are not responsible for exon activation, but exon repression, in agreement with our finding (Fig. 1a–c). Thus, administration of antisense-based RNA processing activators or inhibitors that target or avoid binding sites of splicing factors in introns could be exploited therapeutically to shape beneficial or detrimental consequences of NMD in cancer cells./p>